Minulý týždeň sme zdieľali niekoľko úvah o použití membránovej elektroforézy acetátu celulózy a túto tému tu dnes dokončíme pre vašu referenciu.
Výber z Koncentrácia pufra
Koncentrácia pufra použitá pri membránovej elektroforéze s acetátom celulózy je vo všeobecnosti nižšia ako pri elektroforéze na papieri. Bežne používané pH 8,6BArbitálny tlmivý roztok sa typicky volí v rozsahu 0,05 mol/l až 0,09 mol/l. Pri výbere koncentrácie sa vykoná predbežné určenie. Napríklad, ak je dĺžka membránového pásu medzi elektródami v elektroforetickej komore 8 až 10 cm, je potrebné napätie 25 V na centimeter dĺžky membrány a intenzita prúdu by mala byť 0,4 až 0,5 mA na centimeter šírky membrány. Ak sa tieto hodnoty nedosiahnu alebo prekročia počas elektroforézy, koncentrácia pufra sa má zvýšiť alebo zriediť.
Príliš nízka koncentrácia pufra bude mať za následok rýchly pohyb pásov a zväčšenie šírky pásma. Na druhej strane príliš vysoká koncentrácia pufra spomalí migráciu pásov, čo sťaží rozlíšenie určitých separačných pásov.
Je potrebné poznamenať, že pri membránovej elektroforéze z acetátu celulózy sa značná časť prúdu vedie cez vzorku, čo vytvára značné množstvo tepla. Niekedy môže byť zvolená koncentrácia pufra považovaná za vhodnú. V podmienkach zvýšenej okolitej teploty alebo pri použití vyššieho napätia sa však môže odparovanie vody vplyvom tepla zintenzívniť, čo má za následok nadmerne vysokú koncentráciu pufra a dokonca spôsobiť vysušenie membrány.
Objem vzorky
Pri membránovej elektroforéze s acetátom celulózy je množstvo objemu vzorky určené rôznymi faktormi, vrátane podmienok elektroforézy, vlastností samotnej vzorky, metód farbenia a detekčných techník. Vo všeobecnosti platí, že čím citlivejšia je metóda detekcie, tým menší môže byť objem vzorky, čo je výhodné pre separáciu. Ak je objem vzorky nadmerný, elektroforetické separačné vzory nemusia byť jasné a farbenie môže byť tiež časovo náročné. Pri kvantitatívnej analýze oddelených zafarbených pásov pomocou elučných kolorimetrických detekčných metód by však objem vzorky nemal byť príliš malý, pretože to môže viesť k nižším hodnotám absorbancie pre určité zložky, čo vedie k vyšším chybám pri výpočte ich obsahu. V takýchto prípadoch by sa mal objem vzorky primerane zvýšiť.
Typicky sa objem vzorky pridaný na každý centimeter linky na aplikáciu vzorky pohybuje od 0,1 do 5 μl, čo zodpovedá množstvu vzorky 5 až 1000 μg. Napríklad pri rutinnej elektroforéznej analýze sérového proteínu objem vzorky pridaný na každý centimeter aplikačnej línie vo všeobecnosti nepresahuje 1 μl, čo zodpovedá 60 až 80 μg proteínu. Avšak pri analýze lipoproteínov alebo glykoproteínov pomocou rovnakej elektroforézy je potrebné zodpovedajúcim spôsobom zvýšiť objem vzorky.
Na záver, najvhodnejší objem vzorky by sa mal vybrať na základe špecifických podmienok prostredníctvom série predbežných experimentov.
Výber farbiaceho roztoku
Oddelené pásy pri membránovej elektroforéze z acetátu celulózy sa pred detekciou typicky farbia. Rôzne zložky vzorky vyžadujú rôzne metódy farbenia a metódy farbenia vhodné pre membránovú elektroforézu s acetátom celulózy nemusia byť úplne použiteľné na filtračný papier.
Existujú tri hlavné princípy, pre ktoré si vybrať roztok na farbeniemembrána z acetátu celulózy. po prvé,Vo vode rozpustné farbivá by mali byť uprednostňované pred farbivami rozpustnými v alkohole, aby sa zabránilo zmršťovaniu membrány a deformácii spôsobenej farbiacim roztokom. Po farbení je dôležité opláchnuť membránu vodou a minimalizovať trvanie farbenia. V opačnom prípade sa membrána môže skrútiť alebo scvrknúť, čo by ovplyvnilo následnú detekciu.
Po druhé, je výhodné vybrať pre vzorku farbivá so silnou afinitou k farbeniu. Pri membránovej elektroforéze sérových proteínov s acetátom celulózy sa bežne používa aminočerň 10B pre svoju silnú afinitu k farbeniu pre rôzne zložky sérových proteínov a pre svoju stabilitu.
Po tretie, mali by sa zvoliť spoľahlivé kvalitné farbivá. Niektoré farbivá, napriek tomu, že majú rovnaký názov, môžu obsahovať nečistoty, ktoré po zafarbení spôsobujú obzvlášť tmavé pozadie. To môže dokonca rozmazať pôvodne dobre oddelené pásy, čo sťažuje ich rozlíšenie.
Nakoniec je dôležitá voľba koncentrácie farbiaceho roztoku. Teoreticky by sa mohlo zdať, že vyššia koncentrácia farbiaceho roztoku by viedla k dôkladnejšiemu zafarbeniu zložiek vzorky a lepším výsledkom farbenia. Nie je to však tak. Väzbová afinita medzi zložkami vzorky a farbivom má určitú hranicu, ktorá sa nezvyšuje so zvyšujúcou sa koncentráciou farbiaceho roztoku. Naopak, príliš vysoká koncentrácia farbiaceho roztoku nielenže plytvá farbivom, ale tiež sťažuje dosiahnutie jasného pozadia. Navyše, keď intenzita farby dosiahne určitú maximálnu hodnotu, krivka absorbancie farbiva nesleduje lineárny vzťah, najmä pri kvantitatívnych meraniach. Pri membránovej elektroforéze s acetátom celulózy je koncentrácia farbiaceho roztoku vo všeobecnosti nižšia ako koncentrácia používaná pri papierovej elektroforéze.
Podrobnosti o biotechnológii v Pekingu Liuyi's membrána z acetátu celulózyelektroforéznu nádrž a jej aplikáciu elektroforézy nájdete tu:
lExperiment na separáciu sérového proteínu pomocou acetátovej membrány celulózy
lMembránová elektroforéza s acetátom celulózy
Ak máte nejaký plán nákupu pre naše produkty, neváhajte nás kontaktovať. Môžete nám poslať správu na email[chránený e-mailom]alebo[chránený e-mailom], alebo nám zavolajte na číslo +86 15810650221 alebo pridajte Whatsapp +86 15810650221, alebo Wechat: 15810650221.
Referencia:Elektroforéza (druhé vydanie) od pána Li
Čas odoslania: jún-06-2023