Princíp experimentu
Elektroforéza hemoglobínu je zameraná na detekciu a potvrdenie rôznych normálnych a abnormálnych hemoglobínov.
Vzhľadom na rôzne náboje a izoelektrické body rôznych typov hemoglobínu, v určitom pH tlmivom roztoku, keď je izoelektrický bod hemoglobínu nižší ako pH tlmivého roztoku, nesie hemoglobín záporný náboj a počas elektroforézy migruje smerom k anóde. Naopak, hemoglobín s kladným nábojom sa pohybuje smerom ku katóde.
Pri určitom napätí a po určitom čase elektroforézy vykazujú hemoglobíny s rôznym nábojom a molekulovou hmotnosťou rôzne smery a rýchlosti migrácie. To umožňuje oddelenie odlišných zón a následnú kolorimetrickú alebo elektroforetickú skenovaciu analýzu týchto zón možno vykonať na kvantifikáciu rôznych hemoglobínov. Najčastejšie používanou metódou je membránová elektroforéza z acetátu celulózy s pH 8,6.
V cytoplazme sú etylénglykolové skupiny (CHOH-CHOH) prítomné v glykogénových alebo polysacharidových látkach (ako sú mukopolysacharidy, mukoproteíny, glykoproteíny, glykolipidy atď.) oxidované kyselinou jodistou a konvertované na aldehydové skupiny (CHO-CHO). Tieto aldehydové skupiny sa spájajú s bezfarebným purpurovo-červeným Schiffovým činidlom a vytvárajú purpurovo-červené farbivo, ktoré sa ukladá tam, kde sú v bunke prítomné polysacharidy. Táto reakcia je známa ako farbenie kyselinou periodickou-Schiff (PAS), predtým označované ako farbenie glykogénom.
Experimentálna metóda
Materiály:Acetát celulózypamäťbrane, elektroforézny prístroj(DYCP-38C a napájací zdroj DYY-6C), Špičkový nástroj na načítanie vzoriek (pipeta), spektrofotometer, kolorimetrické kyvety, nárazníky.
vyrovnávacia pamäť:
(1) pH 8,6 TEB pufor: Navážte 10,29 g Tris, 0,6 g EDTA, 3,2 g kyseliny boritej a pridajte destilovanú vodu do 1000 ml.
(2) Borátový pufor: Odvážte 6,87 g bóraxu a 5,56 g kyseliny boritej a pridajte destilovanú vodu do 1000 ml.
Postup:
Poprava hemoglobínového roztoku
Vezmite 3 ml krvi obsahujúcej heparín alebo citrát sodný ako antikoagulant. Centrifugujte pri 2000 ot./min. počas 10 minút a plazmu zlikvidujte. Premyte červené krvinky trikrát fyziologickým roztokom (750 otáčok za minútu, zakaždým 5 minút odstreďovania). Centrifugujte pri 2200 ot./min. počas 10 minút a zlikvidujte supernatant. Pridajte rovnaké množstvo destilovanej vody, potom pridajte 0,5-násobok objemu tetrachlórmetánu. Silne pretrepávajte 5 minút a potom centrifugujte pri 2200 ot./min. počas 10 minút, aby ste zachytili horný roztok Hb na neskoršie použitie.
Namáčanie membrány
Membránu z acetátu celulózy narežte na pásiky s rozmermi 3 cm × 8 cm. Namočte ich do tlmivého roztoku TEB s pH 8,6 až do úplného nasýtenia, potom vyberte a osušte filtračným papierom.
Spotting
Pomocou pipety naneste 10 μl roztoku hemoglobínu vertikálne na membránu z acetátu celulózy (hrubá strana), asi 1,5 cm od okraja.
Elektroforéza
Nalejte borátový tlmivý roztok do elektroforetickej komory. Membránu z acetátu celulózy umiestnite bodkovanou stranou na katódový koniec komory. Bežte 30 minút pri 200 V.
Elúcia
Vystrihnite zóny HbA a HbA2, vložte ich do samostatných skúmaviek a pridajte 15 ml a 3 ml destilovanej vody. Jemne pretrepte, aby sa úplne eluoval hemoglobín, potom premiešajte.
Kolorimetria
Absorbanciu vynulujte použitím destilovanej vody ako elučného roztoku a zmerajte absorbanciu pri 415 nm.
Výpočet
HbA2 (%) = Absorbancia skúmavky HbA2 / (Absorpcia skúmavky HbA × 5 + Absorbancia skúmavky HbA2) × 100 %
Výpočet experimentálnych výsledkov
Referenčné rozmedzie pre pH 8,6 TEB tlmivá elektroforéza s acetátom celulózy: HbA > 95 %, HbA2 1 %-3,1 %
Poznámky
Čas elektroforézy by nemal byť príliš dlhý. Membrána z acetátu celulózy by nemala počas elektroforézy vyschnúť. Zastavte elektroforézu, keď sú HbA a HbA2 jasne oddelené. Predĺžená elektroforéza môže spôsobiť difúziu a rozmazanie pásu.
Vyhnite sa použitiu príliš veľkého množstva vzorky. Nadmerné množstvo tekutého hemoglobínu môže viesť k oddeleniu pásika alebo nedostatočnému zafarbeniu, čo vedie k falošne zvýšeným hladinám HbA.
Zabráňte kontaminácii membrány z acetátu celulózy proteínmi.
Prúd by nemal byť príliš vysoký; inak sa hemoglobínové pásy nemusia oddeliť.
Vždy zahrňte vzorky od normálnych jedincov a potrebné známe abnormálne hemoglobíny ako kontroly.
Beijing Liuyi Biotechnology vyrába profesionálnu elektroforéznu nádrž na elektroforézu hemoglobínu, ktorá je modelomDYCP-38Cnádrž na elektroforézu s membránou z acetátu celulózy a pre nádrž na elektroforézu s membránou z acetátu celulózy sú k dispozícii dva modely napájacieho zdroja pre elektroforézuDYY-2CaDYY-6Cnapájací zdroj.
Medzitým spoločnosť Beijing Liuyi Biotechnology poskytuje zákazníkom membránu z acetátu celulózy a veľkosť membrány z acetátu celulózy je možné prispôsobiť. Vitajte a požiadajte nás o vzorky a ďalšie informácie.
Značka Beijing Liuyi má v Číne viac ako 50-ročnú históriu a spoločnosť môže poskytovať stabilné a vysokokvalitné produkty po celom svete. Počas rokov vývoja si zaslúži vašu voľbu!
Teraz hľadáme partnerov, OEM elektroforézna nádrž aj distribútori sú vítaní.
Ak máte nejaký plán nákupu pre naše produkty, neváhajte nás kontaktovať. Môžete nám poslať správu na email[chránený e-mailom]alebo[chránený e-mailom], alebo nám zavolajte na číslo +86 15810650221 alebo pridajte Whatsapp +86 15810650221, alebo Wechat: 15810650221
Čas odoslania: 20. septembra 2023